鸽新城疫（PigeonNewcastledisease）又称鸽Ⅰ型副粘病毒（PigeonParamyxovirusⅠ，PPMV-Ⅰ）病，是一种由PPMV-Ⅰ引起的一种高度接触性传染病，目前该病毒被归为基因VIb亚型，其基因组为单股负链RNA,而基因VIb亚型可分为VIb1和VIb2两个分支，其中VIb1中毒株又可分为欧洲早期（EU/er）、欧洲近期（EU/ea）、北美（NA）和伊拉克（IQ）4个亚分支[1].

    虽然PPMV-1仅有1个血清型，但是不同毒株间毒力差异很大[2].该病于20世纪70年代末首发于中东地区，并于1985年传入我国香港，同年8月珠海拱北动物检疫局从台湾引进种鸽中检出PPMV-Ⅰ[3].随着经济的发展，我国的信鸽、肉鸽以及观赏鸽的养殖规模迅速扩大，导致了PPMV-Ⅰ病的流行，成为威胁养鸽业的一个重要疫病。目前我国分离到的鸽源NDV大部分为VIb亚型，该型病毒具有明显的宿主亲嗜性；而融合蛋白（F）是NDV重要的毒力因子，是NDV分子生物学研究的重点[4-6],本研究对在鸽群中分离到的7株鸽源NDV的部分生物学特性进行测定，并基于F基因序列对其进行遗传进化分析，以期为鸽ND的防制提供理论依据。

    1、材料与方法

    1.1 鸡胚、阳性血清、试剂RNA提取试剂盒购自原平皓公司，ND标准阳性血清，H5、H9亚型禽流感标准阳性血清由扬州大学传染病实验室制备。AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶均购自Promega公司。DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    1.2 病毒的分离鉴定无菌采集发病鸽的脾、脑、肺、胰腺等组织，后向无菌采集的病料加入1mL四抗PBS,使用高速匀浆机匀浆，组织悬液反复冻融3次后，8000r/min离心5min后，取组织上清接种10日龄SPF鸡胚，0.2mL/胚。接种后定时照胚，弃去24h以内死胚，收集24h以后的死胚，置于4℃冰箱充分冷却收尿囊液，测HA效价，无效价者继续盲传3代。收获尿囊液后，测得其HA效价，若有HA效价，则使用NDV及H5、H9阳性血清进行HI试验。HA及HI试验按照OIE推荐方法进行。病毒纯化使用次代鸡胚成纤维细胞（CEF）以空斑法纯化病毒，连续纯化3代后，挑蚀斑接种10日龄SPF鸡胚，收集24h后的死胚，测得HA效价为阳性者，收取尿囊液，置-70℃保存。

    1.3 病毒RNA提取及反转录参照原平皓生物公司EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒的说明书提取7株NDV的RNA.反转录体系为：33μL洗脱液与3μL6碱基引物置70℃水浴反应10min;后再加入10μLRTbuffer、2μLdNTPs、1μLAMV反转录酶、1μLRRI,置42℃水浴反应2.5h.

    1.4 RT-PCR反应根据GenBank上公布的NDV各基因型的F基因序列设计F片段的通用引物，扩增包含F基因完整ORF的片段，引物序列如下：F1:5′-AAAACACGGGTAGAAGAGTCTGGAT-3′;F2:5′-CTTAAATCTTCCATTGAACAGGTTG-5′。其中PCR反应参数为：10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP0.5μL,上、下游引物各0.5μL,Taq酶0.5μL,模板3μL,加SW至25μL.循环参数：94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸2min,共25个循环；最后72℃充分延伸10min。

    1.5 PCR产物回收和测序PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳完成后胶回收，按照Axygen凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，回收产物全部送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

    1.6 病毒F基因片段的序列分析测序后以基因分析软件DNAStar和MEGA5分析测序结果，将这7株所测定的分离株的F基因序列与其他在GenBank上已有的部分NDV代表株的F基因片段作序列比较，分析F基因的同源性，并根据F基因47~420位核苷酸绘制系统发育进化树。

    2、结果

    2.1 病毒的分离鉴定经尿囊腔接种病料上清的第一代SPF鸡胚均不死亡，且无HA效价，盲传1代后7株分离毒均有HA效价。分离毒株均可被ND阳性血清所抑制，而不能被H5、H9亚型禽流感病毒阳性血清抑制。7株分离株部分生物学特性（表1）。

    2.2 F基因的扩增及序列测定与遗传进化分析用NDV通用引物扩增F基因片段，可获得1700bp左右的条带，使用MeaAlign软件比较7株分离株F基因的同源性，可以发现，本研究中7株分离毒同源性较高，江苏、浙江、山东分离株的核苷酸序列同源性在97.5%~99.5%之间；而7株分离株与我国广泛使用的疫苗株Lasota相比，核苷酸序列的同源性为83.9%~84.7%（表2）。

    基于F基因47~420位的遗传进化分析（图1）表明本研究中的7株NDV均属VIb亚型，国内外的VIb亚型NDV可分为VIb1、VIb2两个分支，本研究中的7株VIb亚型NDV均处VIb1的EU/re这一分支[1],但是7株VIb亚型NDV与我国目前广泛使用的疫苗株Lasota遗传距离较远。

    2.3 F蛋白氨基酸位点分析测序结果表明，所扩增的5株分离株的ORF长度均为1662bp,编码533个氨基酸。使用Lasergene中的MeaAlign软件对本次的7株分离株进行分析，结果表明，7株病毒在F蛋白均含有13个保守的C残基；F蛋白一级结构中含有5个潜在的糖基化位点，分别位于膜外区的85、191、366、447、471位氨基酸和膜内区的541位氨基酸。另外，7株病毒F蛋白的第132、259、380位氨基酸分别为S、H、N,有别于其他基因型的NDV,与文献[7]报道一致。7株病毒的F蛋白裂解位点氨基酸序列均为112RRQKRF117,是典型的NDV强毒株F蛋白裂解位点的氨基酸组成，但是7株分离株的MDT从50~96h不等，ICPI从0.98~1.51不等，说明其毒力并不一致，因此F蛋白裂解位点序列并不是NDV毒力的唯一决定因素。

    3、讨论

    遗传进化分析结果表明，本研究中的7株NDV病毒均属VIb亚型。核苷酸和氨基酸序列同源性分析表明，7株分离株之间同源性较高，推测这7株病毒具有共同起源。但7株分离株与目前广泛使用的疫苗株Lasota遗传距离较远，这也许是免疫鸽群发生感染的原因之一。

    VIb亚型NDV又可被分为两个分支，即VIb1、VIb2,本研究的中7株VIb亚型NDV均处于VIb1中的EU/re这一分支，说明这几株VIb亚型NDV与欧洲型毒株有着比较近的遗传关系。符子华[8]等从新疆分离到的3株VIb亚型NDV同样与Italy/1166/00、99106（France）最接近，认为新疆鸽源NDV流行株与欧洲型毒株有着共同的起源，综合已有报道可以发现近些年的鸽源VIb亚型NDV分离株中EU/re这一分支的毒株占主要优势。而刘华雷等[9]报道的VIb亚型NDV分离株NC9701、YZ9712、PB960、黎俊君等[10]报道的2株广东分离株NDV/GD-1与NDV/GD-3均处于VIb1的NA分支，年代最近的NA分支国内分离株为2009年于安徽分离到的P/Anhui1/09,因此NA分支的VIb亚型NDV在我国依然存在。基因VIb亚型NDV的F蛋白裂解位点的氨基酸序列呈现多样性，我国VIb亚型NDV分离株F蛋白裂解位点序列有112RRQKRF117、112RRQKRF117和112KRQKRF1173种，本研究中7株VIb亚型NDV的F蛋白裂解位点均为112RRQKRF117,呈典型的强毒特征。虽然本研究中7株分离株裂解位点均呈现强毒特点，但ICPI值差异较大，说明其毒力由多种因素共同决定，这与Dortmans等[11]观点一致。

    研究表明VIb亚型NDV具有明显的宿主亲嗜性，尤其对雏鸽危害很大，成年鸽感染后排毒可达2周；SPF鸡攻毒后，虽然并不能使SPF鸡出现临床症状，但是也可检测到排毒[12].Dortmans等[13]发现将PPMV-1在鸡体内多次传代后ICPI由0.44升至0.90,因此VIb亚型NDV必须引起我们的重视，鸽群与鸡群需严格隔离饲养。

    国内的VIb亚型NDV病毒来源并不一致，既有欧洲型又有美洲型，并且也并没有因为地理位置的不同而表现出明显的差异，推测这与候鸟迁徙、信鸽比赛以及引种等有关。目前VIb亚型NDV仍然为鸽群中ND的优势流行株，并且存在对鸡毒力增强的潜在风险，需提高警惕。此外，VIb亚型NDV与广泛使用的疫苗株Lasota同源性不高，并且现有的血清学研究表明LaSota血清不能有效中和VIb亚型NDV[7,14],因此需研制和推广针对信鸽VIb亚型巴拉米哥（NDV）感染的新型疫苗。

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